Yeast immunofluorescent staining -- Immunofluorescent Staining of Yeast: SDS Permeabilization Metho.

Materials:
1)1.0MKPO4pH6.5:Makebymixing33mlsof1MK2HPO4with
67 mls of 1M KH2PO4
2)0.1M  KPO4 pH 6.5
  3)  0.1M  KPO4  pH  7.5:  Make  500  mls  by  mixing  41.7  mls  of  1M
K2HPO4  and  8.3  mls  of  1M  KH2PO4  with  450  mls  of  ddH2O
  4)  37%  Formaldehyde
  5)  KS  Buffer:  0.1  M  KPO4  pH  7.5/1.2  M  Sorbitol
  6)  Zymolyase  100T:5  mg/ml  solution  in  0.1M  KPO4/0.5%  β-
mercaptoethanol
  7)  β-mercaptoethanol
  8)  HS  Buffer:  0.1  M  Hepes  pH  7.4/1.0  M  Sorbitol
  9)  HS/SDS  Buffer:  0.1  M  Hepes  pH  7.4/1.0  M  Sorbitol/0.5%  SDS
10)  0.1  %  Polylysine  (MW  >300,000;  Sigma  Cat.  No.  P-1524)  Stored
in  1ml  or  10  ml  aliquots  at  -20°C.After  thawing  microfuge
aliquot  for  5  min.  at  4°C  before  adding  to  slides.
11) Multiwell  teflon  masked  slides  (Carlson  Scientific  Inc.  Peotone
IL.  Cat.  No.100806)
12) PBT  Buffer:  PBS  with1  mg/ml  BSA  and  0.02%  Tween  20
13) PrimaryAntibodies:  Affinity  purified  polyclonal  antibodies  or
monoclonal  antibodies  from  cell  culture  supernatant  (notfrom
ascites  fluid). Dilutions  must  be  determined  emperically  for  each
primary  but  common  ranges  are  for  affinity  purified  sera  1:10
to  1:100  in  PBT  Buffer.  For  cell  culture  supernatants  1:1  to  1:5
dilutions  are  normally  used  (if  cell  supernatants  were
concentrated  by  ammonium  sulfate  precipitation  then  1:10  to1:50
dilutions  are  often  used). After  diluting  in  PBT  buffer  spin
secondary  in  microfuge  (at  4°C)  for  5  min  to  pellet  any  debris.
14) SecondaryAntibodies:  Jackson  Immunoresearch  Laboratories
makes  high  quality  secondary  antibodies  which  are  good  for
both  single  and  double  labeling  experiments.  We've  been  using:
Texas  Red  conjugated  AffiniPure  Donkey  Anti-Mouse  IgG
(Cat#715-075-141)  and  Fluorescein  (DTAF)  conjugated
AffiniPure  Donkey  Anti-Rabbit  IgG  (Cat#711-015-132). They
are  sent  as  freeze-dried  powder  which  should  be  reconstituted
with  ddH2O  according  to  directions  and  then  aliquoted  into  50
µl/tube  (marked  with  name  of  Ab  and  Date)  and  frozen  on  dry
ice  and  stored  in  the  "Secondary  Antibodies"  Box  in  the  -80°C
Freezer.  After  thawing  an  aliquot  keep  it  at  4°C--it  should  be
good  for  about  a  month. These  secondary  Abs  work  very  well
for  both  double  and  single  labeling  and  should  be  used  at  1:50
to  1:100  dilutions  each  (in  PBT  buffer).  After  diluting  in  PBT
the  solution  should  be  microfuged  for  5  min  at  4°C  to  remove
any  precipitates  that  may  have  formed.
15) Mounting  Medium:Dissolve  10  mg  of  ρ-phenylenediamine
(Sigma  Cat.  No.  P-6001)  in  1  ml  of  1M  K2HP04 in  a  1.5  ml
eppendorf  tube. Vortex  vigorously  for  several  minutes,  cover
with  foil,  and  rock  on  nutator  for  20-30  minutes. Vortex  again
and  microfuge  for  5  min. Remove  the  top  800  µl  to  a  15  ml
tube. Add  7.2  ml  of  glycerol  and  mix  by  vortexing. Divide  into
500  µl  aliquots  and  store  at  -80°C  (in  the  "Secondary  Ab"  Box).  
Optional:  For  nuclear  staining  DAPI  can  be  added  to  mounting
medium  as  follows:make  a  1  mg/ml  DAPI  (4',6-diamidino-2-
phenylindole  dihydrochloride)  solution  in  water,  dilute  it  1:100
with  water  and  add  2.25  µl  to  1  ml  of  mounting  media.
Method:
1)For  each  strain  to  be  examined  inoculate  50  mls  of  YPD  or  SD
(with  the  appropriate  amino  acid  supplements).  Grow  overnight  at
25°C  until  culture  is  at  a  OD599  between  0.5  and  0.8.For  examing
unshifted  cells  proceed  directly  to  Step  2.For  examining  sec7ts and
sec6ts  strains  spin  cells  out  of  YPD  at  OD599  of  0.5-0.6  and  resuspend
in  the  same  volume  of  YP  with  0.2%  Glucose  and  then  incubate  in  a
37°C  shaking  water  bath  for  2  hrs.  Check  OD599  and  then  cool  for  5
min  on  ice  until  the  culture  is  at  room  temperature  before  fixing.
2 ) Fix  yeast  directly  in  the  culture  by  adding  to  each  50  mls  of
culture:  5  mls  of  1.0  M  KPO4 pH  6.5  and  6  mls  of  37%  Formaldehyde
directly  to  the  culture  flask. Incubate  at  room  temperature  with
gentle  shaking  for  30  min. Transfer  an  amount  of  cells  that  is  equal
to  about  5-10  OD599  units  for  each  culture  into  a  50  ml  centrifuge
tube  and  spin  in  the  Beckman  table-top  centrifuge  for  5  min.  at  2000
RPM  at  25°C.Aspirate  off  the  supernatant  and  resuspend  e